Uredio Peter Sarnow, Medicinski fakultet Sveučilišta Stanford, Sveučilište Stanford, Kalifornija, odobreno 25. prosinca 2020. (pregledano 25. listopada 2020.)
Izvještavamo o interakciji između podjedinica u replikaciji kompleksa transkripcija koronavirusa, koji su ključni za replikaciju i evolucijsko očuvanje.Pružili smo dokaze da NiRAN domena povezana s nsp12 ima aktivnost nukleozid monofosfat (NMP) transferaze u transu i identificirali nsp9 (protein koji veže RNA) kao svoju metu.NiRAN katalizira kovalentno vezanje NMP ostatka na konzervirani amino terminus nsp9 u reakciji koja se oslanja na Mn2+ ione i susjedne konzervirane Asn ostatke.Utvrđeno je da su NiRAN aktivnost i nsp9 NMPilacija bitni za replikaciju koronavirusa.Podaci nam omogućuju da povežemo ovu aktivnost enzimskog markera ugniježđenog virusa s prethodnim opažanjima u hipotezi da je početak sinteze RNA u klasi RNA virusa funkcionalno i evolucijski dosljedan.
RNK-ovisna RNK polimeraza (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae i 12 drugih obitelji) povezana je s amino-terminalnom (N-terminalnom) domenom u nestrukturnom proteinu (nsp) koji se oslobađa iz poliproteina, nazvan NiRAN 1ab se sastoji od virusne glavne proteaze (Mpro).Prethodno je objavljena aktivnost vlastite GMPilacije/UMPilacije arterijskog virusa NiRAN-RdRp nsp, i sugerirano je da se generira prijelazna pojava za prijenos nukleozid monofosfata (NMP) u (trenutačno nepoznat) virus i/ili Stvari biopolimerizacije stanica.Ovdje pokazujemo da koronavirus (Humani Coronavirus [HCoV]-229E i Koronavirus 2 teškog akutnog respiratornog sindroma) nsp12 (NiRAN-RdRp) ima Mn2+-ovisnu aktivnost NMPilacije, koja je izvedena iz nsp9 kroz stvaranje Mpro-posredovanog nsp9 nakon N-terminalni bočni nssp je proteolitički otpušten, fosforamidat je vezan na primarni amin (N3825) na N-terminalu nsp9.Uridin trifosfat je preferirani nukleotid u ovoj reakciji, ali adenozin trifosfat, gvanozin trifosfat i citidin trifosfat također su prikladni kosupstrati.Studije mutacije korištenjem rekombinantnih proteina nsp9 i nsp12 koronavirusa i genetski modificiranih mutanata HCoV-229E odredile su ostatke potrebne za nsp9 NMPilaciju posredovanu NiRAN-om i replikaciju virusa u staničnoj kulturi.Podaci su potvrdili predviđanje ostataka NiRAN aktivnog mjesta i odredili važnu ulogu nsp9 N3826 ostataka u nsp9 NMPilaciji i replikaciji virusa in vitro.Ovaj je ostatak dio očuvane N-terminalne NNE tripeptidne sekvence i pokazao se kao jedini nepromjenjivi ostatak nsp9 i njegovih homologa u obitelji koronavirusa.Ova studija pruža solidnu osnovu za funkcionalno proučavanje aktivnosti NMPilacije drugih ugniježđenih virusa i predlaže moguće ciljeve za razvoj antivirusnih lijekova.
Nidovirales pozitivno-lančani RNA virus inficira razne kralježnjake i beskralješnjake (1, 2).Red trenutačno uključuje 14 obitelji (3), od kojih je obitelj Coronavirus opsežno proučavana u posljednjih 20 godina.U to su vrijeme tri zoonotska koronavirusa proizašla iz životinjskih domaćina i izazvala velike epidemije teških respiratornih infekcija kod ljudi.Uključujući trajne pandemije uzrokovane teškim akutnim zaraznim bolestima.Respiratorni sindrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidovirusi dijele zajedničku organizaciju genoma, a podjedinica membranski vezanog replikacijsko-transkripcijskog kompleksa (RTC) kodirana je u dvije trećine 5-?²-terminala i glavne strukturne podjedinice virusne čestice, kao i neki dodaci .Protein, kodiran u 3??² krajnjoj trećini genoma (1).Osim jedne obitelji planarskih virusa (Monoviridae) (8), svi ugniježđeni virusi kodiraju RTC podjedinice u dva velika otvorena okvira čitanja (ORF) ORF1a i ORF1b, koji su prevedeni iz genomske RNA.ORF1a kodira poliprotein (pp) 1a, a ORF1a i ORF1b zajedno kodiraju pp1ab.Uz opće sudjelovanje glavne proteaze (Mpro) koju kodira ORF1a, i pp1a i pp1ab se proteolitički procesiraju u niz nestrukturnih proteina (nsps), također poznatih kao 3CLpro, jer ima homologiju s 3Cpro pikornavirusa ( 9).Smatra se da su ovi nsps sastavljeni u veliki dinamički RTC, kataliziraju sintezu genomske RNA (replikacija) i skupa subgenomske RNA (transkripcija), te se koriste za koordinaciju ekspresije ORF-a koji se nalazi nizvodno od ORF1b (10?? ?12).
Temeljni RTC uključuje RNA-ovisnu RNA-polimerazu (RdRp) (13), helikazu superfamilije 1 (HEL1) (14, 15) i nekoliko enzima za obradu RNA, koji su uglavnom kodirani u ORF1b i u obitelji koronavirusa. Sadrži nsp12-nsp16 i nsp9-nsp12 u obitelji Arterioviridae (vidi referencu 10ââ 12).RdRp i HEL1 predstavljaju dvije (jedna petina) očuvane domene virusa ptičjeg gnijezda i imaju homologiju među drugim RNA virusima.Vjeruje se da replikazi jezgre pomažu druge podjedinice, uključujući nekoliko malih nssp otpuštenih iz karboksi-terminalne (C-terminalne) regije pp1a, nizvodno od Mpro (koronavirus nsp5 i arterijski virus nsp4).Imaju ograničenu zaštitu specifičnu za obitelj i raznolike aktivnosti (pregledano u referenci 10ââ12).
Relativno nedavno je pronađena domena s jedinstvenim karakteristikama motiva sekvence na amino terminusu (N-terminus) uz RdRp u svim ugniježđenim virusima, ali nijednom drugom RNA virusu (16).Na temelju svog položaja i aktivnosti nukleotidne transferaze (nukleozid monofosfat [NMP] transferaza), ova se domena naziva NiRAN (nukleotidna transferaza povezana s Nestvirus RdRp).Kombinacija NiRAN-RdRp s dvostrukom domenom čini nsp12 u obitelji Coronaviridae i nsp9 u obitelji Arterioviridae, au drugim nestoviridama očekuje se da će se NiRAN-RdRp otpustiti kao neovisni nsp iz virusnog poliproteina.U koronavirusu, NiRAN domena sadrži ??1/450 ostataka i povezana je s C-terminalnom RdRp domenom preko vezne regije (16-19).U virusu konjskog arteritisa (EAV) (Arteriviridae), rekombinantni nsp9 pokazuje aktivnosti UMPilacije i GMPilacije ovisne (samo) o ionu Mn2+, koje ovise o tri očuvane baze sekvence u nestovirusu, AN, BN i CN ostaci u sekvenci.Gdje N označava NiRAN) (16).N-terminalni bočni dio ovih motiva je manje konzervativan motiv preAN.Neki od tih ostataka također su konzervirani u daleko srodnim protein kinazama, gdje se pokazalo da su uključeni u vezanje nukleozid trifosfata (NTP) i katalitičku aktivnost (20, 21).U skladu s ovim opažanjem, nekoliko ključnih ostataka aktivnih mjesta u pseudokinazi SelO iz Pseudomonas syringae može se sastaviti s nedavno objavljenim superkompleksom SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Konzervirani NiRAN ostaci koronavirusa superponirani u elektronskoj mikrostrukturi.Rekombinantni protein (17).Nagađa se da će dokumentirana (samo)U/GMPilacija proizvesti prolazno stanje za prijenos NMP-a na (trenutačno nepoznati) supstrat (16), a strukturna sličnost između NiRAN-a i protein kinaze (17, 19) ) Je li hipoteza da NiRAN modificira druge proteine.
Mnoge značajke, uključujući njegovu jedinstvenu i jedinstvenu sustavnu povezanost s ugniježđenim virusima i genetsko odvajanje od RdRp-a, čine NiRAN razumnim ključnim regulatornim enzimom za ugniježđene viruse, što je ključno za njihov nastanak i identitet.Prije su se nazivale tri moguće funkcije koje uključuju NiRAN za regulaciju genomske/subgenomske translacije ili replikacije/transkripcije.S obzirom na oskudne i nepotpune podatke koji su tada bili dostupni, svaka funkcija ima svoje prednosti i nedostatke (16).U ovom istraživanju, cilj nam je kombinirati biokemijske i obrnute genetske studije koronavirusa koji predstavljaju dva roda i staviti naša otkrića u evolucijsku pozadinu prirodne mutacije obitelji koronavirusa, kako bismo dobili uvid u ovo Tajanstveno carstvo.Izvještavamo o velikom napretku u razumijevanju NiRAN-a kroz identifikaciju prirodnih ciljeva u RTC-u, što (među tri dostupne hipoteze) doprinosi ulozi ove domene u pokretanju sinteze ugniježđene virusne RNA.Ovo istraživanje također otvara mogućnosti za druge uloge NiRAN-a na sučelju domaćina virusa.
Kako bismo karakterizirali enzimska svojstva NiRAN domene povezane s korona virusom nsp12, proizveli smo rekombinantni oblik ljudskog koronavirusa 229E (HCoV-229E) nsp12 u E. coli, s oznakom His6 na C-kraju, i kombinirali protein s [α32-P] Inkubirajte zajedno s NTP u prisutnosti MnCl2 kao što je opisano u Materijalima i metodama.Analiza produkta reakcije pokazala je prisutnost radioaktivno obilježenog proteina koji migrira zajedno s nsp12 (106 kDa), što ukazuje da nsp12 koronavirusa katalizira stvaranje kovalentnih adukata protein-NMP, koji se preferirano formiraju s uridin monofosfatom (UMP) (Slika 1A) i B).Kvantitativna analiza pokazala je da se u usporedbi s drugim nukleotidima intenzitet signala ugradnje UMP-a povećao 2 do 3 puta (Slika 1C).Ovi su podaci u skladu s predviđenom aktivnošću NMP transferaze NiRAN domene koronavirusa (16), ali pokazuju da su nukleotidne preferencije NiRAN domene koronavirusa i arterijskog virusa različite.
Aktivnost samo-NMPilacije HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) inkubiran je s označenim [α-32P] NTP u prisutnosti 6 mM MnCl2 tijekom 30 minuta (vidi Materijale i metode za detalje).Produkti reakcije su odvojeni pomoću SDS-PAGE i obojeni Coomassie briljantno plavim.(B) Radioaktivno obilježeni protein vizualizira se fosfornim snimanjem.Položaji nsp12-His6 i markera molekularne mase proteina (u kilodaltonima) prikazani su u A i B. (C) Intenzitet radioaktivnog signala (srednja vrijednost ± SEM) određen je iz tri neovisna eksperimenta.*P≤0,05.Snaga signala (postotak) povezana je s UTP-om.
Iako se pokazalo da su enzimske aktivnosti povezane s NiRAN-om ključne za replikaciju EAV-a i SARS-CoV-a u staničnoj kulturi (16), specifična funkcija NiRAN-a i potencijalni ciljevi još nisu utvrđeni.Nedavno objavljena strukturna sličnost između NiRAN-a i obitelji proteina s naborima sličnim protein kinazi (17, 22) potaknula nas je da testiramo hipotezu da NiRAN katalizira NMPilaciju drugih proteina.Generirali smo skup potencijalnih homolognih ciljeva, uključujući nestrukturne proteine kodirane pomoću HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), od kojih svaki sadrži C-terminalnu His6 oznaku (SI dodatak, tablica S1), i inkubirati ove proteine s [α32-P] uridin trifosfatom ([α32-P]UTP) u prisutnosti ili odsutnosti nsp12.Goveđi serumski albumin i MBP-LacZα fuzijski protein proizvedeni u E. coli služili su kao kontrole (Slika 2A, trake 1 do 7).Radioaktivno obilježeni protein analiziran je elektroforezom na natrijevom dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) i autoradiografijom, te je otkriveno da postoji jak radioaktivni signal u reakciji koja sadrži nsp12 i nsp9.Položaj signala odgovara molekularnoj masi nsp9, što ukazuje na UMPilaciju nsp9 posredovanu nsp12 (Slika 2B, traka 7).Nije pronađen nijedan drugi testni protein koji je UMPiliran, što nas je dovelo do zaključka da je nsp9 specifičan supstrat nsp12.U skladu s podacima o samo-NMPilaciji prikazanim na slici 1, nsp12 može prenijeti sva četiri NMP-a na nsp9, iako je učinkovitost drugačija, UMP> adenozin monofosfat (AMP)> gvanozin monofosfat (GMP)> citidin monofosfat (CMP) ) ( Slika).3 A i B).Pod uvjetima korištenim u ovom testu (skratite vrijeme reakcije i izlaganja, smanjite koncentraciju nsp12; materijali i metode), samo-NMPilacija nsp12 nije se mogla otkriti (usporedite sliku 2B, traku 7 i sliku 1B), što pokazao se učinkovit (i više krugova) UMP premješten s nsp12 na nsp9.Za aktivnost UMP transferaze potrebna je prisutnost Mn2+ iona, kao što je prikazano na slici 3C, dok je uočena samo minimalna aktivnost UMP transferaze u prisutnosti Mg2+, a nikakva aktivnost u prisutnosti druga dva ispitana dvovalentna kationa.Slični podaci dobiveni su u testovima NMPilacije koji sadrže citidin trifosfat (CTP), gvanozin trifosfat (GTP) i adenozin trifosfat (ATP) (SI dodatak, slika S1).
UMPilacija nsp9 posredovana HCoV-229E nsp12.Niz proteinskih supstrata (uključujući goveđi serumski albumin, MBP-lacZα i niz HCoV-229E nsps obilježenih s C-terminalnim His6 kodiranim s ORF1a) korišten je za procjenu UMPilacijske aktivnosti posredovane HCoV-229E nsp12-His6⁺ protein.Inkubirajte protein s [α-32P] UTP 10 minuta u odsutnosti (A) ili prisutnosti (B) nsp12 kao što je opisano u materijalima i metodama.Na vrhu A i B prikazan je SDS-poliakrilamidni gel obojen Coomassie Brilliant Blue, a na dnu A i B prikazani su odgovarajući autoradiogrami.Položaj markera molekulske mase proteina (u kilodaltonima) dan je lijevo.Položaj nsp12-His6 (B, gore) i radioaktivni signal uočen tijekom inkubacije nsp12-His6 s nsp9-His6 (B, traka 7) također su naznačeni, što ukazuje da [α-32P]UMP u nsp9-His6 (12,9 kDa), što nije primijećeno za druge testirane proteine.
Biokemijska i virološka karakterizacija nsp9 NMPilacije posredovana HCoV-229E NiRAN-om.(A i B) Uloga nukleotidnog ko-supstrata korištenog u reakciji.Nsp12-His6 i nsp9-His6 se miješaju i inkubiraju u prisutnosti različitih [α-32P] NTP-ova u standardnom testu NMPilacije.(A, gore) Coomassie obojen nsp9-His6 odvojen pomoću SDS-PAGE.(A, dolje) Autoradiograf istog područja gela.(B) Relativna aktivnost (srednja vrijednost ± SEM) u prisutnosti naznačenog nukleotidnog kofaktora određena je iz tri neovisna eksperimenta.*P≤0,05.(C) Uloga metalnih iona.Prikazan je standardni test NMPilacije u prisutnosti [α-32P] UTP i različitih metalnih iona, svaki s koncentracijom od 1 mM.U C, gore, prikazan je Coomassie obojen nsp9-His6, a u C, dolje, prikazana je odgovarajuća autoradiografija.Veličina obilježenog proteina (u kilodaltonima) prikazana je lijevo od A i C. (D) Mutantni oblik HCoV-229E nsp12-His6 koji nosi specificiranu aminokiselinsku supstituciju je u [α-32P]UTP, kako je opisano u Materijali i metode.Radioaktivno obilježeni nsp9-His6 proizveden u reakciji NMPilacije detektira se slikanjem fosforilacije (D, gore).Relativna aktivnost u usporedbi s proteinom divljeg tipa (wt) prikazana je u D, a dno je uzeto kao prosjek (±SEM) iz tri nezavisna eksperimenta.Zvjezdice označavaju zamjene nekonzerviranih ostataka.(E) Titar virusa u supernatantu kulture p1 stanica dobivenih 24 sata nakon infekcije određen je testom plaka.Naznačene su zamjene kodona u NiRAN domeni konstruiranog mutanta HCoV-229E (numeriranje ostataka temelji se na njihovom položaju u pp1ab).Mutant RdRp aktivnog mjesta nsp12_DD4823/4AA s nedostatkom replikacije korišten je kao kontrola.
Kako bismo stekli dublje razumijevanje aktivnog mjesta NiRAN-a i odredili ostatke povezane s aktivnošću nsp9-specifične NMP transferaze, proveli smo analizu mutacija, u kojoj smo zamijenili konzervativne ostatke u NiRAN AN, BN i CN motivima ( 16) To je Ala (SI dodatak, slika S2).Osim toga, utjecaj konzervativnih supstitucija Arg-u-Lys ili Lys-u-Arg procijenjen je u dva slučaja.Kao (negativna) kontrola, ostaci koji nisu ili su manje očuvani u NiRAN domeni koronavirusa i drugih ugniježđenih virusa zamijenjeni su Ala. Zamjena K4116A (u motivu preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiv BN) i D4280A (CN) značajno smanjuje ili čak eliminira nsp9 NMPilaciju kroz nsp12, dok proteini s konzervativnim supstitucijama (R4178K), K4116R) zadržavaju 60% i 80% svoje aktivnosti, što ukazuje da popuštanje restrikcija na njihovoj strani lanaca je fizikalno-kemijski osjetljiv (Slika 3D).Zamjena nekoliko drugih očuvanih ostataka E4145A, D4273A, F4281A i D4283A mnogo je manje štetna, a nsp9 UMPilacija samo je umjereno smanjena.Slični rezultati dobiveni su u reakcijama nsp9 NMPilacije koje uključuju druge NTP-ove (Slika 3D i dodatak SI, Slika S3), potvrđujući da su promatrani učinci na specifične supstitucije aminokiselina neovisni o vrsti korištenog nukleotidnog ko-supstrata.Zatim smo testirali mogući utjecaj ovih supstitucija nsp12 na replikaciju koronavirusa u staničnoj kulturi.U tu smo svrhu upotrijebili odgovarajuće genetski modificirane komplementarne DNA (cDNA) predloške klonirane u rekombinantnom virusu vakcinije (23, 24) za transkripciju 5-7 stanica.Titracija infektivnog virusnog potomstva proizvedenog u tim stanicama pokazala je da većina HCoV-229E NiRAN mutanata nije izvediva (Slika 3E).Skupina neživih virusnih mutanata uključuje alternative za koje se pokazalo da eliminiraju ili značajno smanjuju aktivnost NMP transferaze in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ali postoje dvije druge alternative (K4116R, E4145A) 80 % Rezervirano?Njihova in vitro aktivnost NMPilacije sugerira da su uključena dodatna ograničenja.Slično, dvije druge mutacije (R4178K, F4281A) koje su uzrokovale umjereno smanjenje NiRAN-ove in vitro aktivnosti NMPilacije proizvele su žive viruse, međutim, ti su virusi značajno smanjili titre replikacijom.U skladu s in vitro podacima o aktivnosti prikazanim na slici 3D, zamjenom četiri druga ostatka koji nisu sačuvani u koronavirusu i/ili drugim ugniježđenim virusima (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) proizveli su održive viruse. Potomci, unatoč tome što su imali umjereno smanjeni titar u usporedbi s divljim tipom virusa (Slika 3E).
Kako bi se proučilo ovisi li aktivnost NMP transferaze posredovana NiRAN-om o aktivnoj RdRp domeni, dva očuvana Asp ostatka uključena u koordinaciju dvovalentnih metalnih iona (11) u RdRp motivu C zamijenjena su s Ala. Rezultirajući protein nsp12_DD4823/4AA zadržava njegovu aktivnost nsp9 NMPilacije, što ukazuje da aktivnost in vitro nsp9 NMPilacije posredovana nsp12 ne zahtijeva aktivnost polimeraze (SI dodatak, slika S4).
Nakon utvrđivanja aktivnosti NMP transferaze specifične za nsp9 za nsp12, pokušali smo karakterizirati adukt NMP-nsp9 masenom spektrometrijom (MS).Potpuni maseni spektar proteina rekombinantnog HCoV-229E nsp9 pokazao je vrhunac na 12,045 Da (Slika 4A).Dodavanje nsp12 nije promijenilo kvalitetu nsp9, što ukazuje da nsp12 i nsp9 ne bi tvorili stabilan kompleks pod korištenim uvjetima (denaturacija) (Slika 4A).U prisutnosti UTP-a i GTP-a, mjerenje mase reakcije koja sadrži nsp9 odnosno nsp12 pokazalo je da se proteinska masa UTP-a pomaknula 306 Da, a proteinska masa GTP-a pomaknula se 345 Da, što ukazuje da svaka molekula nsp9 veže UMP ili GMP (Slika 4) C i D).Nagađa se da energija potrebna za nsp9 NMPilaciju posredovanu NiRAN-om dolazi od hidrolize NTP-a i oslobađanja pirofosfata.Iako je u ovoj reakciji korišten 10-struki molarni višak nsp9 (cilja) u odnosu na nsp12 (enzim), primijećena je gotovo potpuna NMPilacija nsp9, što ukazuje da je interakcija između nsp12 i nsp9 kratkotrajna, a nsp12 može NMPilirati više nsp9 in vitro molekula.
Pojedinačna NMPilacija nsp9 u prisutnosti nsp12 i UTP ili GTP.Prikazan je dekonvoluirani potpuni maseni spektar proteina HCoV-229E nsp9 (SI dodatak, tablica S1) (AD).(A) sam nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 u prisutnosti UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 u prisutnosti GTP.
Da bi se odredili nsp9 ostaci UMPilirani pomoću nsp12, nsp9-UMP je cijepan tripsinom.Dobiveni peptidi razdvojeni su nano-high performance tekućom kromatografijom (HPLC) i analizirani tandemskom spektrometrijom mase (MS/MS) online.Analiza podataka pomoću softverskog paketa Byonic (Protein Metrics) pokazala je UMPilaciju N-terminalne aminokiseline.Ovo se potvrđuje ručno.Tandemski maseni spektar prekursora peptida [UMP]NNEIMPGK (SI dodatak, slika S5A) otkrio je fragment pri 421 m/z, što ukazuje da se UMP veže na ostatak 1 nsp9.
Na N-kraju nsp9, Asn je sačuvan među članovima Orthocoronavirinae (SI dodatak, slika S6).Iako vjerujemo da je N-terminalni dušik primarnog amina najvjerojatniji akceptor za UMP, odlučili smo pribaviti dodatne dokaze o vezanju NMP na N-terminalu.Iz tog razloga, ne-NMPilirani i NMPilirani N-terminalni peptid nsp9 pročišćen HPLC-om izveden je u prisutnosti acetona i natrijevog cijanoborhidrida.Pod ovim uvjetima, samo slobodni primarni amini mogu se modificirati propilom (25).N-terminalni peptid izveden iz nsp9 sa sekvencom NNEIMPGK sadrži dva primarna amina, jedan na N-kraju Asn i drugi na bočnom lancu Lys na C-kraju.Stoga se propilne skupine mogu uvesti na oba kraja.Ekstrahirani ionski kromatogrami ne-NMPiliranih peptida prikazani su u SI dodatku, slika S5B.Kao što se i očekivalo, mogu se identificirati N-terminalni i C-terminalni (mono)propilirani (SI dodatak, slika S5B, gornja traka) i dipropilirani peptidi (SI dodatak, slika S5B, donja traka).Ovaj se obrazac mijenja upotrebom NMP-piliranog N-terminalnog peptida nsp9.U ovom slučaju mogu se identificirati samo C-terminalni propilirani peptidi, ali N-terminalni propilirani peptidi i dipropilirani peptidi nisu identificirani (SI dodatak, slika S5C), što ukazuje da je UMP prenesen na N-terminalni primarni amin kako bi se to spriječilo grupi od unošenja promjena.
Zatim zamjenjujemo (s Ala ili Ser) ili brišemo očuvane ostatke na N-kraju nsp9 kako bismo definirali ograničenja specifična za cilj.Na temelju naših MS podataka koji pokazuju da NiRAN tvori nsp9-NMP adukt s primarnim aminom N-terminalnog ostatka nsp9, pretpostavili smo da nsp9 NMPilacija zahtijeva virusnu glavnu proteazu (Mpro, nsp5) za oslobađanje nsp9 N-terminala iz njegov poliproteinski prekursor.Kako bismo testirali ovu hipotezu, proizveli smo prekursorski protein nsp7-11 koji sadrži nsp9 u E. coli i proveli standardni test NMPilacije u prisutnosti [α-32P] UTP (materijali i metode).Kao što je prikazano na slici 5A (traka 3), neobrezani prekursor nsp7-11 nije radioaktivno obilježen s nsp12.Nasuprot tome, ako se nsp7-11 cijepa rekombinantnim nsp5 kako bi se oslobodio nsp9 (i drugi nssp) iz prekursora, otkriva se radioaktivno obilježeni protein koji migrira s nsp9, potvrđujući naš zaključak da NiRAN i N-selektivna tvorba kovalentnih nsp9-NMP adukata .Terminalni primarni amin N-terminalnog Asn (pozicija 3825 u pp1a/pp1ab).Ovaj zaključak je također podržan eksperimentima koji koriste konstrukt nsp9, koji sadrži jedan ili dva dodatna ostatka na N-kraju.U oba slučaja, UMPilacija nsp9 posredovana NiRAN-om je ukinuta (SI dodatak, slika S7).Zatim smo proizveli protein s jednim ili dva Asn ostatka izbrisana iz peptidne sekvence 3825-NNEIMPK-3832 na N-terminalu nsp9.U oba slučaja, nsp9 UMPilacija bila je potpuno blokirana (Slika 5B), pružajući dodatne dokaze da pravi nsp9 N-terminus djeluje kao NMP receptor.
Proteolitička obrada nsp9 i uloga N-terminalnih ostataka u UMPilaciji posredovanoj nsp12.(A) nsp9 UMPilacija zahtijeva slobodan nsp9 N-terminal.Nsp7-11-His6 je prethodno inkubiran na 30 °C u puferu za detekciju NMPilacije koji sadrži UTP u prisutnosti ili odsutnosti rekombinantnog Mpro (nsp5-His6).Nakon 3 sata započnite test NMPilacije dodavanjem nsp12-His6 kako je opisano u Materijalima i metodama.Reakcija koja je sadržavala nsp5-His6 (linija 1) i nsp9-His6 (linija 2) korištena je kao kontrola.Nakon 10 minuta, reakcija je prekinuta i reakcijska smjesa je odvojena pomoću SDS-PAGE.Protein je obojen s Coomassie Brilliant Blue (A, gore).Prekursor Nsp7-11-His6 i prerađeni produkt koji je rezultat cijepanja posredovanog nsp5-His6 prikazani su desno.Imajte na umu (zbog njihove male veličine) da se nsp7 i nsp11-His6 ne mogu otkriti u ovom gelu, a reakcija je nadopunjena s nsp5-His6 (trake 1 i 4; položaj nsp5-His6 označen je punim krugom) ili nsp9-His6 (traka 2) sadrži malu količinu MBP-a (označeno otvorenim kružićima) kao rezidualne nečistoće jer se izražavaju kao MBP fuzijski proteini (SI dodatak, Tablica S1).(B) Varijanta Nsp9-His6 nema jedan ili dva N-terminalna Asn ostatka (numeriranje ostataka prema položaju u pp1a/pp1ab) te je pročišćena i inkubirana s nsp12-His6 i [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE obojena Coomassie prikazana je na vrhu, B, odgovarajući autoradiograf prikazan je na dnu.Položaj markera molekularne težine (u kilodaltonima) prikazan je lijevo.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminalni konzervirani ostaci zamijenjeni su Ala ili Ser, a ista količina proteina korištena je u reakciji UMPilacije posredovane nsp12-His6.Reakcijski produkti su odvojeni SDS-PAGE i obojeni Coomassie Brilliant Blue (C, gore), a radioaktivno obilježeni nsp9-His6 detektiran je fosforescencijom (C, sredina).Koristeći protein divljeg tipa (wt) kao referencu (postavljenu na 100%), relativna aktivnost NMPilacije (srednja vrijednost ± SEM) izračunata je iz tri neovisna eksperimenta.(D) Titri virusa u supernatantu p1 stanične kulture Huh-7 stanica inficiranih s HCoV-229E divljim tipom Huh-7 stanica, i mutanti koji nose određene aminokiselinske supstitucije u nsp9 određeni su testom plaka.Dvostruki mutant RdRp motiva C DD4823/4AA s nedostatkom replikacije korišten je kao negativna kontrola.
N-kraj nsp9 (osobito položaji 1, 2, 3 i 6) vrlo je očuvan među članovima potporodice Orthocoronavirinae (SI dodatak, slika S6).Kako bi se proučila moguća uloga ovih ostataka u NMPilaciji nsp9 posredovanoj nsp12, dva uzastopna Asn ostatka na N-kraju nsp9 zamijenjena su s Ala ili Ser (samim ili u kombinaciji).U usporedbi s divljim tipom nsp9, zamjena N3825 s Ala ili Ser rezultirala je više od dvostrukog smanjenja UMPilacije posredovane nsp12 (Slika 5C).U skladu s našim zaključkom da se NMPilacija događa na N-terminalnom primarnom aminu umjesto na bočnom lancu N-terminalnog ostatka, uočili smo značajnu zaostalu NMPilaciju sa zamjenom N3825A i N3825S.Zanimljivo, ako je drugi Asn zamijenjen Ala ili Ser, nsp9 UMPilacija se jače smanjuje (više od 10 puta), dok zamjena Ala na pozicijama 3, 4 i 6 ima samo umjeren učinak na nsp9 UMPilaciju (Slika 2 ) .5C).Slični rezultati dobiveni su korištenjem ATP-a, CTP-a ili GTP-a (SI dodatak, slika S8).Zajedno, ovi podaci ukazuju na ključnu ulogu N2826 (pozicija 2 u nsp9) u nsp9 NMPilaciji.
Kako bismo dobili dodatne dokaze o funkcionalnoj korelaciji između N-kraja nsp9 i NMPilacije, izvršili smo višestruko poravnanje sekvenci (MSA) sekvence nsp9 obitelji Coronavirusa (koja varira između 104 i 113 ostataka) (SI dodatak, slika S6).Ukupno, u 47 (poznatih i pretpostavljenih) vrsta iz 5 rodova potporodice Orthocoronavirinae koje inficiraju različite sisavce, ptice i gmazove domaćine, samo je ukupno 8 ostataka pronađeno kao nepromjenjivo.Najopsežnije promjene, uključujući brisanja i umetanja, primijećene su u ciklusima između sekundarnih strukturnih elemenata nsp9, kako je utvrđeno prethodnim strukturnim studijama (26-28).Pet nepromjenjivih ostataka pronađeno je u β niti i α spirali C-terminalnog dijela nsp9.Tri nepromjenjiva ostatka čine NNE motiv N završetka nsp9.Otkriveno je da je drugi Asn ovog motiva jedini nepromjenjivi ostatak, koji također dijeli hipotetski nsp9 daleko srodnog žabljeg koronavirusa, i predstavlja vrstu Microhyla letovirus 1 u potporodici Letovirinae Alphaletovirusa.Očuvanje ostataka u elementima sekundarne strukture nsp9 može se racionalizirati strukturnim razmatranjima kako bi se održalo savijanje ili poznata svojstva vezanja RNA.Međutim, čini se da se ovo razmišljanje ne odnosi na očuvanje NNE, a prije ove studije, priroda ograničenja koja ograničavaju varijaciju tripeptidne sekvence bila je potpuno zamagljena.
Kako bismo odredili važnost nsp9-NMPilacije i očuvanja NNE u replikaciji koronavirusa, proizveli smo mutante HCoV-229E, koji nose jednostruke ili dvostruke supstitucije nsp9 N-terminalnih ostataka, što ukazuje da je nsp9 NMPilacija štetna in vitro.Prije nego što počnemo, pokušat ćemo odgovoriti na pitanje utječu li ove supstitucije (u blizini mjesta cijepanja nsp8|9) na proteolitičku obradu C-terminalne pp1a regije.Skup nsp7-11 poliproteinskih konstrukata koji sadrže odgovarajuće supstitucije na N-terminusu nsp9 proizvedeni su u E. coli i izrezani s rekombinantnim Mpro.Na proteolitičko cijepanje četiriju mjesta (uključujući bočno mjesto nsp9) ne utječu značajno nikakve uvedene supstitucije (SI dodatak, slika S9), isključujući strukturne promjene u tim proteinima koje ometaju cijepanje nsp8|9 posredovano Mpro (ili drugo) web stranica.
Stanice Huh-7 transficirane su HCoV-229E RNA duljine genoma, koja kodira Ala ili Ser supstitucije u očuvanim NNE tripeptidima (N3825, N3826 i E3827) na nsp9 N terminalu, pokazujući da je većina mutacija fatalna.Uspjeli smo spasiti virus zamjenom Ser ili Ala N-terminalnog Asn (N2835A ili N2835S), ali nismo uspjeli oporaviti virus drugim jednostrukim i dvostrukim mutacijama u NNE sekvenci (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Slika 5D).
Ovi rezultati pokazuju da je replikacija koronavirusa u kulturi tkiva ograničena (ista ili slična), ograničavajući prirodnu mutaciju mjesta NMPilacije nsp9 u tijelu i podržavajući ključnu ulogu ovog odgovora u životnom ciklusu koronavirusa.
U posljednjem nizu eksperimenata proizveli smo C-terminalni His6 označen SARS-CoV-2 nsp12 i nsp9 i dva mutantna oblika nsp12 u E. coli.Ostaci aktivnog mjesta u domenama NiRAN i RdRp bili su redom upotrijebite Ala umjesto (Slika 6A i SI dodatak, Tablica S2).K4465 u SARS-CoV-2 nsp12 odgovara K4135 u HCoV-229E (SI Dodatak, Slika S2), koji se pokazao potrebnim za NiRAN aktivnost i replikaciju HCoV-229E (Slika 3D i E).Ovaj ostatak također odgovara ostatku arterijskog virusa EAV nsp9 K94, za koji se prethodno pokazalo da je neophodan za NiRAN samoUMPilaciju/samo-GMPilaciju (16).Kao što je prikazano na slici 6B, SARS-CoV-2 nsp12 ima aktivnost UMP transferaze koristeći nsp9 kao supstrat, dok je mutant aktivnog mjesta nsp12_K4465A neaktivan.Dvostruka supstitucija u SDD karakterističnoj sekvenci RdRp motiva C ne utječe na aktivnost UMP transferaze (Slika 6B), što ukazuje da aktivnost RdRp nema izravan učinak na nsp9 UMPilaciju.Slični podaci dobiveni su pomoću CTP-a, GTP-a i ATP-a (SI dodatak, slika S10).Ukratko, ovi podaci pokazuju da nsp9 NMPilacija posredovana NiRAN-om ima konzervativnu aktivnost u koronavirusima koji predstavljaju različite rodove podobitelji ortokoronavirusa.
NMPilacija nsp9 posredovana SARS-CoV-2 nsp12.(A) Coomassie obojen SDS-poliakrilamidni gel koji pokazuje rekombinantni protein korišten u testu NMPilacije.Kao kontrola korišten je mutirani protein sa supstitucijom aktivnog mjesta u NiRAN domeni (K4465A) i RdRp domeni (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12.Numeriranje ostataka temelji se na položaju u pp1ab.(B) Autoradiograf otkrivanja UMPilacije korištenjem nsp9-His6 i [α-32P]UTP kao supstrata nsp12-His6 (divlji tip [wt] i mutant).Molekularna masa (u kilodaltonima) označenog proteina prikazana je lijevo.
NiRAN domene općenito su očuvane u Nidovirales (16), što ukazuje da kataliziraju enzimske reakcije bitne za replikaciju Nidovirusa.U ovoj smo studiji uspjeli dokazati da NiRAN domena koronavirusa prenosi NMP (generiran iz NTP-a) u nsp9, misteriozni RNA vezni protein koji je uključen u replikaciju virusa (26 ?? 29), kako bi ga odredili kao prirodnu metu i partner coronavirus RTC-a.
Domena NiRAN dijeli tri sekvencijska motiva (AN, BN i CN), koji sadrže vrlo mali broj ostataka koji su sačuvani u svim obiteljima u monofiletskom, ali visoko diferenciranom redu Nidovirales (8, 16).Nedavne studije pokazale su da su strukturno povezani s uglavnom neobilježenom obitelji proteina sličnih protein kinazama, koji su izvorno nazvani obitelj SelO (17, 19, 22, 30, 31).Proteini povezani sa SelO imaju kinazne nabore, ali nemaju nekoliko ostataka očuvanih aktivnih mjesta u klasičnim kinazama (22, 32).Na temelju obrnute orijentacije molekula ATP-a vezanih na aktivno mjesto i stabiliziranih specifičnim interakcijama, pretpostavljeno je i naknadno potvrđeno da SelO prenosi AMP (umjesto fosfata) na proteinski supstrat (22), dok drugi bakterijski protein sličan SelO-u YdiU ima nedavno je pokazano da katalizira kovalentno vezanje UMP-a na Tyr i His ostatke različitih proteinskih supstrata (33).
Kako bismo potvrdili i proširili predviđanje ostataka pretpostavljenih aktivnih mjesta NiRAN domene koronavirusa, upotrijebili smo biokemijske i metode obrnute genetike za izvođenje analize mutacije na koronavirusu nsp12 (Slika 3D i E i SI dodatak, Slika S3 i tablica) S1â S4).Podaci pokazuju da zamjena HCoV-229E K4135, R4178 i D4280 s Ala eliminira in vitro aktivnost NMP transferaze i replikaciju virusa u staničnoj kulturi (Slika 3D i dodaci E i SI, Slika S3), podupirući njihovu prisutnost u NTP γ-fosfatu (K4135, R4178) i koordinacija metalnih iona aktivnog mjesta (D4280).E4145A supstitucija konzerviranog Glu u rasponu virusa ptičjeg gnijezda za koji je predviđeno da stabilizira položaj K4135 (17) pokazala se da eliminira replikaciju virusa, ali iznenađujuće, aktivnost je zadržana u in vitro testu NMPilacije (Slika 3D i E i SI dodatak, slika S3 i tablice S1–S4).Slično je opažano kada je odgovarajuća zamjena uvedena u YdiU homolog Salmonella typhimurium (E130A) (33).Uzeti zajedno, ovi podaci podržavaju regulatornu funkciju ovog sačuvanog ostatka, a ne katalitičku funkciju.
Zamjena konzerviranog Phe ostatka (F4281A) unutar raspona nestovirusa u HCoV-229E NiRAN domeni (8) rezultirala je smanjenjem aktivnosti NMPilacije in vitro i značajnim smanjenjem replikacije virusa u staničnoj kulturi (Slika 3D, E i SI) dodatak, slika S3).Podaci su u skladu s važnom regulatornom funkcijom ovog ostatka, kao što je homologni DFG motiv Phe ostatak prikazan prije.U klasičnim protein kinazama, on je dio Mg2+ vezne petlje i pomaže u sastavljanju i regulaciji kralježnice???Potreban za učinkovitu katalitičku aktivnost (32, 34).Zamjena Ala i Arg za K4116 ostatke (u preAN motivu), redom, eliminirala je replikaciju virusa i, kao što se očekivalo, imala je različite učinke na aktivnost NMP transferaze in vitro, ovisno o uvedenom bočnom lancu aminokiseline (Slika 3D i dodaci E i SI , slika S3).Funkcionalni podaci u skladu su sa strukturnim informacijama, što ukazuje da je ovaj ostatak uspostavio interakciju s ATP fosfatom (17).U NiRAN domeni drugih obitelji ugniježđenih virusa, položaj HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 zauzimaju Lys, Arg ili His (8), što ukazuje da je funkcionalna restrikcija ovog specifičnog ostatka ublažena.Supstitucija D4188A i D4283A eliminira ili snažno smanjuje aktivnost enzima i eliminira replikaciju virusa (Slika 3).Ta su dva ostatka sačuvana u većini (ali ne u svim) ugniježđenih virusa (8), što ukazuje na važnu funkciju specifičnu za obitelj, ali vjerojatno nekatalitičku.Ala supstitucije nekoliko drugih Lys i Asp ostataka (K4113A, D4180A, D4197A i D4273A) koji nisu sačuvani u Coronaviridae ili drugim obiteljima Nestioviridae (8) korištene su kao kontrole.Kao što se i očekivalo, ove su supstitucije uglavnom podnošljive, s blagim smanjenjem aktivnosti enzima i replikacije virusa u nekim slučajevima (Slika 3 i SI dodatak, Slika S3).Sveukupno, podaci o mutagenezi koronavirusa vrlo su u skladu s vlastitim GMP i obrnutim genetičkim podacima EAV NiRAN-RdRp (16), u kojem EAV nsp9 (ortolog koronavirusa nsp12) ostatak K94 (odgovara HCoV- 229E K4135) ima važne funkcije), R124 (odgovara R4178), D132 (odgovara D4188), D165 (odgovara D4280), F166 (odgovara F4281).Osim toga, podaci o mutagenezi HCoV-229E dosljedni su i prošireni na prethodno objavljene podatke o obrnutoj genetici SARS-CoV (16), jednako slični onima koji su primijećeni za odgovarajući CN motiv Phe-to-Ala mutanta SARS-CoV_nsp12 opisani fenotip -F219A i HCoV-229E_F4281A (Slika 3 D i E i dodatak SI, Slika S3 i Tablica S1-S4).
U usporedbi s EAV ortolozima (16), koji imaju jasnu sklonost prema UTP i GTP (u reakciji samoNMPilacije), naša studija pokazuje da se NiRAN domena koronavirusa (koju predstavljaju HCoV-229E i SARS-CoV-2) može učinkovito prenesena su sva četiri NMP-a, iako postoji mala sklonost UMP-u (slike 1 i 3).Relativno niska specifičnost specifičnog NTP ko-supstrata u skladu je s nedavno objavljenom superkompozitnom strukturom SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, u kojoj se ADP-Mg2+ veže na aktivno mjesto NiRAN-a, ali ne i na adeninski dio stvaranja specifičnih interakcija (17).U našem istraživanju, vrsta nukleotida korištenog u reakciji NMPilacije nema različit učinak na aktivnost mutantnog proteina (SI dodatak, slika S3), što ukazuje da niti jedan od ovih ostataka nije usko povezan s vezanjem specifične nukleobaze.Strukturalnu osnovu i potencijalni biološki značaj različitih preferencija ko-supstrata NTP uočenih u NiRAN domenama koronavirusa i arterijskih virusa tek treba proučiti;oni mogu biti istiniti ili mogu biti posljedica ograničenja njihovih studija.Trenutačno se ne može isključiti da potencijalna aktivnost NMPilatora NiRAN domene arterijskog virusa (u usporedbi s prethodno karakteriziranom aktivnošću samoNMPilacije) ima različitu ko-supstratnu preferenciju, uzimajući u obzir da je sličnost između arterijskog virusa i virusa korona NiRAN domena je na svom limitu.Usporedba na temelju niza (16).U usporedbi s pseudokinazom SelO, koja koristi Mg2+ kao kofaktor, aktivnost koronavirusa i arterijskog virusa NiRAN ovisi o Mn2+ (16) (Slika 3C i dodatak SI, Slika S1).Ovisnost o Mn2+ i očigledna sklonost UTP-u neobična je značajka proteinskih NMPilatora, a tek je nedavno potvrđena u YdiU proteinu Salmonelle typhimurium, koji katalizira striktno Mn2+-ovisnu proteinsku šaperonsku UMPilaciju kako bi zaštitio stanice od indukcije stresa Stanični skup ATP-a ( 33).
Nedavno opisana strukturna sličnost između NiRAN domene koronavirusa i staničnih protein kinaza (17, 19) pruža dodatnu potporu sposobnosti NiRAN-a da kovalentno poveže NMP s drugim proteinima o kojima smo izvijestili u ovoj studiji.Usmjerili smo našu potragu za mogućim ciljevima NiRAN-a na proteine kodirane HCoV-229E ORF1a, za koje je poznato da izravno ili neizravno pomažu RTC-ovoj replikazi kodiranoj ORF1b (12, 35).Naši eksperimenti daju uvjerljive dokaze za učinkovitu i specifičnu NMPilaciju nsp9 (Slika 2).Ako se ciljani protein koristi u molarnom višku koji je 8 do 10 puta veći od enzima (nsp12), potvrđuje se da je nsp9 potpuno (mono)NMP-iziran (Slika 4).Zaključili smo da je interakcija između nsp12 i nsp9 kratkotrajna i da neće tvoriti stabilan kompleks s nsp9 (u nedostatku drugih RTC podjedinica).Ovaj zaključak podupiru studije interakcije proteina na proteomu SARS-CoV (35).MS analiza identificirala je primarni amin N-terminalnog ostatka nsp9 kao mjesto NMPilacije (SI dodatak, Slika S5).Formiranje fosforamidatne veze i N-terminalne amino skupine razlikuje aktivnost NMPilacije posredovanu NiRAN-om od reakcije AMPilacije posredovane Pseudomonas syringae SelO, koja katalizira stvaranje O-povezanog AMP-a na Ser, Thr ili Tyr ostacima Peptidni adukt ( 22), a S. typhimurium YdiU tvori O-vezane (s Tyr) i N-vezane (s His) adukte peptid-UMP.Ograničene informacije dostupne o SelO obitelji proteina pokazuju da se članovi ove velike proteinske obitelji uvelike razlikuju u formiranju adukata peptid-NMP.Ovo je zanimljivo opažanje koje zaslužuje daljnje proučavanje.
Podaci dobiveni u ovoj studiji doveli su nas do hipoteze da NMPilacija nsp9 zahtijeva slobodni N-kraj.U kontekstu replikacije virusa, to će biti omogućeno proteolitičkim cijepanjem mjesta obrade nsp8|nsp9 u poliproteinu replikaze pp1a posredovanom Mpro i pp1ab.Kod većine koronavirusa, razlika između ovog specifičnog mjesta (VKLQ|NNEI u HCoV-229E) i svih drugih mjesta cijepanja Mpro koronavirusa je u tome što Asn (umjesto drugog malog ostatka, kao što je Ala, Ser ili Gly) zauzima P1â???Mjesto (36).Podaci o cijepanju peptida dobiveni u ranim studijama pokazali su da je učinkovitost cijepanja mjesta nsp8|nsp9 niža od učinkovitosti drugih mjesta, što ukazuje da 1) ovo specifično mjesto može imati regulatornu ulogu u pravodobnoj koordiniranoj obradi C-terminala pp1a regija, ili 2) a Uloga posebnog konzerviranog N-kraja nsp9 u replikaciji virusa (37).Naši podaci (Slika 5A) pokazali su da je rekombinantni oblik nsp9 koji nosi pravi N-terminalni slijed bio učinkovito NMP-iziran pomoću nsp12.N-terminalna bočna sekvenca uklonjena je faktorom Xa (nsp9-His6; SI dodatak, tablica S1) ili Mpro-posredovanim cijepanjem (nsp7-11-His6; slika 5A i SI dodatak, tablica S1).Važno je da je neobrezani prekursor nsp7-11-His6 koji sadrži nsp9 pokazao otpornost na NMPilaciju nsp12, što je u skladu s našim podacima, što ukazuje da se adukt nsp9-NMP formira kroz N-terminalni primarni amin (SI dodatak, slika S5) .Da bismo stekli dublje razumijevanje specifičnosti NiRAN supstrata, zatim smo se usredotočili na susjedne N-terminalne ostatke nsp9.U nedostatku drugih proteina, oni su strukturno fleksibilni, sprječavajući njihovo otkrivanje u neobilježenom obliku nsp9 (26, 28, 38), što ukazuje na njihovu ograničenu prirodnu varijaciju. To je zbog važne sekvencije specifične (ne povezane sa sekundarnom strukturom) funkcija nsp9 N-terminalnog fragmenta.Ala supstitucije konzerviranih ostataka u ovoj regiji (slike 5C i D i dodatak SI, slika S8) otkrivaju da je N3826 bitan za NMPilaciju nsp9 in vitro, dok supstitucije N3825A i E3827A dovode do smanjenja NMPilacije, dok supstitucije M3829A i P3830A ne .Očito utječe na nsp9 NMPilaciju.Iako supstitucija N-terminalnog Asn (N3825A, N3825S) ima samo umjeren učinak na nsp9 NMPilaciju i replikaciju virusa u staničnoj kulturi (Slika 5C i D), brisanje sekvence Asn ostatka iz N-terminalnog 3825-NN dipeptida pokazalo se smrtonosnim za viruse, što ukazuje da je potreban jedan Asn ostatak prije drugog ostatka na N-kraju, po mogućnosti Asn, iako se čini da se zamjena sličnih ostataka može djelomično tolerirati (Slika 5B, C i D).Zaključujemo da dipeptid 3825-NN, posebno očuvani i esencijalni ostatak N3826 unutar raspona koronavirusa (dodatak SI, slika S6), osigurava ispravno vezanje i orijentaciju N-kraja nsp9 na aktivnom mjestu NiRAN-a.
Zamjena Ala (E3827A) za očuvani Glu svih podfamilija zadržava nsp9 NMPilaciju in vitro, ali je smrtonosna za viruse u staničnoj kulturi (Slika 5C i D), što ukazuje na dodatnu funkciju ovog ostatka, na primjer, u ključnim interakcijama (NMPilirani ili nemodificirani ) nsp9 N-kraj i drugi čimbenici uključeni u replikaciju virusa.Mutacije Nsp9 nisu utjecale na proteolitički proces nsp9 ili bilo kojeg susjednog nssp (39) (SI Dodatak, Slika S9), što ukazuje da letalni fenotipovi nekoliko opaženih mutacija nsp9 nisu bili uzrokovani disregulacijom C proteolitičkog procesa-terminalnog područja pp1a .
Gornji podaci pružaju dokaz da se nakon Mpro-posredovanog tretmana mjesta cijepanja nsp8|9 u pp1a/pp1ab, N-kraj nsp9 može UMPilirati (ili djelomično modificirati s drugim NMP).Osim toga, izvrsna očuvanost N-kraja nsp9 (uključujući singularne i nepromjenjive Asn ostatke u obitelji koronavirusa) i podaci o obrnutoj genetici dobiveni u ovoj studiji (slike 3E i 5D) doveli su nas do zaključka da je opisana NMPilacija nsp9 je biološki povezan i neophodan za replikaciju koronavirusa.Funkcionalne posljedice ove modifikacije tek treba proučiti, na primjer, s obzirom na prethodno opisanu (nespecifičnu) nsp9 (nemodificirani oblik) aktivnost vezanja RNA (2628).N-terminalna NMPilacija također može utjecati na interakciju nsp9 s proteinskim ili RNA supstratima ili na formiranje različitih sklopova od četiri razine.Oni su primijećeni u strukturnim studijama i potvrđeno je da su funkcionalno povezani s replikacijom koronavirusa, iako posebno u odsutnosti U slučaju ove modifikacije (26-ââ29, 40).
Iako ciljanu specifičnost NiRAN domene koronavirusa tek treba detaljnije okarakterizirati, naši podaci pokazuju da je ciljana specifičnost proteina NiRAN domene koronavirusa vrlo uska.Iako očuvanje ključnih ostataka aktivnog mjesta (8, 16) u NiRAN domeni svih obitelji nidovirusa snažno podupire aktivnost konzerviranih NMPylator ovih proteina, identitet džepnih ostataka koji se vežu na supstrat ove domene Konzervacija i očuvanje tek treba okarakterizirati , i mogu se razlikovati između različitih obitelji namjena Nidovirales.Slično, relevantne mete drugih ugniježđenih virusa tek treba utvrditi.Oni mogu biti udaljeni ortolozi nsp9 ili drugih proteina, jer su sekvence izvan pet domena replikaza koje su općenito očuvane u ugniježđenim virusima manje očuvane (8), uključujući niz genoma između Mpro i NiRAN. Među njima, nsp9 se nalazi u korona virus.
Osim toga, trenutno ne možemo isključiti mogućnost da NiRAN domena ima dodatne (uključujući mobilne) ciljeve.U ovom slučaju, vrijedno je spomenuti da se čini da bakterijski homolozi u ovom novom proteinu NMPylators (NMPylators) (30, 31) imaju "glavne regulatore"?NMP modulira niz staničnih proteina kako bi regulirao ili eliminirao njihove nizvodne aktivnosti, čime igra ulogu u raznim biološkim procesima, kao što je stanični odgovor na stres i redoks homeostaza (22, 33).
U ovoj studiji (Slike 2 i 4 i Dodatak SI, Slike S3 i S5), uspjeli smo dokazati da je nsp12 prenio UMP (NMP) dio na jednu (sačuvanu) poziciju u nsp9, dok drugi proteini nisu modificirani u korišten Pod tim uvjetima podržana je dobro definirana (a ne labava) specifičnost supstrata.U skladu s tim, u usporedbi s N-terminalnom NMPilacijom nsp9, vlastita aktivnost NMPilacije nsp12 je vrlo niska, njeno otkrivanje zahtijeva duže vrijeme izlaganja autoradiografiji, a koristi se 10-struko povećanje koncentracije nsp12.Osim toga, naša MS analiza nije uspjela pružiti dokaze za NMPilaciju nsp12, što sugerira da je samoNMPilacija NiRAN domene (u najboljem slučaju) sekundarna aktivnost.Međutim, treba napomenuti da su druge studije pružile preliminarne dokaze da status samoAMPilacije bakterijskog NMPylatora može kontrolirati njihovu aktivnost NMPilacije na drugim proteinskim supstratima (22, 33).Stoga je potrebno dodatno istraživanje kako bi se istražili mogući funkcionalni učinci aktivnosti samo-NMPilacije prijavljenih za EAV nsp9 (16) i koronavirus nsp12 (ova studija), uključujući predloženi učinak sličan pratiocu na savijanje C-terminalne RdRp domene ( 16) ).
Prethodno je razmatrano nekoliko hipoteza u vezi s mogućim nizvodnim funkcijama nidoviralne NiRAN domene, uključujući RNA ligazu, RNA-prekrivenu gvanilat transferazu i početnu aktivnost proteina (16), ali nijedna od njih nije kompatibilna s dostupnim nizvodnim funkcijama.Podaci dobiveni u sljedećim položajima točno su isto vrijeme bez dodatnih pretpostavki.Podaci dobiveni u ovoj studiji najviše su u skladu s (ali ne mogu dokazati) da je NiRAN domena uključena u inicijaciju sinteze RNA inducirane proteinima.Prethodno se vjerovalo da funkcija NiRAN domene u 5??Ovi i podrška drugih podataka ne utječu na reakcije zatvaranja ²-RNA ili ligacije RNA.Stoga se, na primjer, smatra da aktivno mjesto NiRAN-a uključuje očuvani Asp kao opću bazu (D252 u Pseudomonas syringae SelO; D4271 u HCoV-229E pp1ab; D208 u SARS-CoV-2 nsp12) (SI dodatak, slika 2 ).S2) (17, 22, 33), dok katalizu u ATP-ovisnoj RNA ligazi i enzimu za zatvaranje RNA provodi kovalentni enzim-(lizil-N)-NMP međuprodukt, koji uključuje nepromijenjeni Lys ostatak ( 41).Osim toga, izvanredna specifičnost NiRAN-a koronavirusa temeljena na sekvenci za očuvane proteinske mete i opuštena specifičnost za ko-supstrate NTP (preferira UTP) suprotstavlja se funkcijama zatvaranja enzima posredovanog NiRAN-om ili funkcijama sličnim ligazama RNA.
Očito je potrebno puno dodatnog rada da se potvrdi i, ako se dokaže, razradi moguća uloga nsp9-UMP (nsp9-NMP) u sintezi RNA izazvanoj proteinima, što će povezati nekoliko zanimljivih, ali (do sada) izvješća o kojima je ranije objavljeno .Izolirana opažanja.Na primjer, utvrđeno je da kraj negativnog lanca RNA koronavirusa počinje s oligo(U) lancem (42, 43).Ovo opažanje je u skladu s idejom da se sinteza negativnog lanca RNA pokreće vezanjem UMPiliranog oblika nsp9 na poli(A) rep (okidači), što može biti potaknuto njegovim vezanjem RNA Aktivnost i/ili interakcija s drugi RTC protein.Dio UMP-a koji daje nsp9 može se zatim koristiti kao "primer" za oligouridilaciju posredovanu nsp7/8/nsp12, koristeći rep 3??²-poly(A) u genomskoj RNA ili drugoj sekvenci koja sadrži oligo(A) služi kao predložak, sličan mehanizmu uspostavljenom za protein VPg pikornavirusa (44).Što ako je prijedlog “nenormativan”????Pokretanje (proteinom izazvane) sinteze negativnog lanca RNA pruža poveznicu s opažanjima, ukazujući na to da RNA negativnog lanca koronavirusa ima UMP (umjesto UTP) na svom kraju (42), što se smatra znakom da nukleinska kiselina Dicer cijepa kraj fosforiliran nepoznatom endonukleazom specifičnom za uridin.Ako se potvrdi, ova hidrolitička aktivnost nukleinske kiseline može pomoći u otpuštanju oligomernog UMPiliranog oblika nsp9 s 5² kraja novonastalog negativnog lanca.Moguća uloga nsp9 u pripremi proteina također je u skladu s prethodnim studijama obrnute genetike, koje su pokazale da nsp9 (i nsp8) kritično i specifično interaguju s konzerviranim cis-djelujućim RNA elementom blizu 3 kraja genoma koronavirusa.45).Prema ovom izvješću, ova prethodna zapažanja sada se mogu preispitati i proširiti kroz daljnja istraživanja.
Ukratko, naši podaci određuju specifičnu aktivnost vlasničke ugniježđene virusne enzimske oznake povezane s RdRp na N-kraju.Kod koronavirusa, ova novootkrivena aktivnost UMPylator/NMPylator posredovana NiRAN-om koristi se za oslanjanje na Mn2+ i susjedne Asn ostatke i uzrokuje stvaranje (niskoenergetskih) fosforamidatnih veza s N-terminalnim primarnim aminom.Putem Mpro-posredovanog cijepanja na mjestu cijepanja nsp8|9, cilj nsp9 može se koristiti za NMPilaciju, što ukazuje na funkcionalno spajanje između proteaze i NiRAN domene, koja se proteže do RdRp.Očuvanje ključnih ostataka u aktivnom mjestu nsp12 NiRAN i cilj nsp9, u kombinaciji s podacima dobivenim od dva koronavirusa, uključujući SARS-CoV-2, pruža snažne dokaze da je NMPilacija nsp9 koronavirus. Konzervativne značajke također su ključni korak u replikaciji virusa.Dostupni podaci navode nas na zaključak da je specifična uloga NMPiliranog oblika nsp9 u sintezi RNK izazvanoj proteinima razuman scenarij za koronavirus i druge ugniježđene viruse, a NiRAN također može ciljati na druge neidentificirane proteine.Regulirajte virus.Interakcija domaćina.Ako se potvrdi, uključenost proteinskih početnica u sintezu virusne RNA povećat će afinitet sekvence Mpro/3CLpro i RdRp domena između prethodno otkrivenog koronavirusa i superskupine slične pikornavirusu (9), koje su sada objedinjene u nedavno uspostavljenim Pisonivirites ( 46) u kategoriji.
Naši podaci također pokazuju da se osnovne, selektivne i konzervativne aktivnosti enzima identificirane u ovoj studiji mogu koristiti kao mete za antivirusne lijekove.Spojevi koji ometaju vezanje (i naknadnu modifikaciju) očuvanog N-terminusa nsp9 u aktivnom mjestu NiRAN-a mogu se razviti u učinkovite i svestrane antivirusne lijekove, prikladne za liječenje životinjskih i ljudskih koronavirusa iz različitih (pod)rodova infekcija , uključujući SARS-CoV-2 i koronavirus Bliskoistočnog respiratornog sindroma.
Kodirajuća sekvenca proteina koronavirusa proizvedenog u ovoj studiji umnožena je RT-PCR-om pomoću RNA izolirane iz Huh-7 zaraženog s HCoV-229E ili Vero E6 zaraženog sa SARS-CoV-2, i umetnuta korištenjem standardnih postupaka kloniranja.vektor ekspresije pMAL-c2 (Biološki laboratorij Nove Engleske) ili pASK3-Ub-CHis6 (47) (Dodatak SI, tablice S1 i S2).Pojedinačne supstitucije kodona uvedene su mutagenezom usmjerenom na PCR (48).Za proizvodnju fuzijskog proteina MBP, stanice E. coli TB1 transformirane su odgovarajućim pMAL-c2 plazmidnim konstruktom (SI dodatak, Tablica S1).Fuzijski protein je pročišćen amiloznom afinitetnom kromatografijom i odcijepljen faktorom Xa.Nakon toga, C-terminalni His6-označeni protein je pročišćen Ni-imobiliziranom metalnom afinitetnom kromatografijom (Ni-IMAC) kako je prethodno opisano (49).Za proizvodnju fuzijskog proteina ubikvitina, stanice E. coli TB1 koristile su odgovarajući plazmidni konstrukt pASK3-Ub-CHis6 (Dodatak SI, tablice S1 i S2) i pCGI plazmidnu DNA koja kodira ubikvitin-specifičnu C-terminalnu hidrolazu 1 (Ubp1).Preobrazba (47).C-terminalni His6-označeni koronavirusni protein pročišćen je kako je prethodno opisano (50).
Test samo-NMPilacije HCoV-229E nsp12-His6 proveden je kako je opisano u EAV nsp9 (16).Ukratko, nsp12-His6 (0,5 µM) sadrži 50 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin-etansulfonske kiseline (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM ditiotreitola (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM pufera, inkubirati navedeni NTP i 0,17 µM odgovara [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) na 30 °C tijekom 30 minuta.U svim ostalim (standardnim) testovima NMPilacije nsp12-posredovane nsp9 NMPilacije, reakcijski uvjeti su prilagođeni kako slijedi: nsp12-His6 (0,05 µM) i nsp9-His6 (4 µM) u prisutnosti 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM označenog NTP-a i 0,17 µM odgovarajućeg [α32-P]NTP.Nakon inkubacije od 10 minuta na 30°C, reakcijski uzorak je pomiješan s puferom uzorka SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hidroksimetil)aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerol i 0,005% bromofenol plava.Protein je denaturiran zagrijavanjem na 90 °C tijekom 5 minuta i odvojen pomoću 12% SDS-PAGE.Gel se fiksira i boji otopinom Coomassie Brilliant Blue (40% metanol, 10% octena kiselina, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), obezboji se i izloži fosforescentnom slikovnom ekranu 20 sati (kako bi se otkrio nsp12 iz NMPilacije) ili (maksimalno) 2 sata (za procjenu nsp9 NMPilacije).Za skeniranje ekrana korišten je Typhoon 9200 imager (GE Healthcare), a za analizu intenziteta signala korišten je ImageJ.
Za MS analizu korišteno je 1 µM nsp12-His6 i 10 µM nsp9 (bez heksahistidinske oznake) u analizi NMPilacije (SI dodatak, tablica S1) i korištena je povećana koncentracija od 500 µM UTP i GTP.Ovisno o njihovoj koncentraciji i očekivanoj kvaliteti proteina, Waters ACQUITY H-Class HPLC sustav opremljen MassPrep kolonom (Waters) korišten je za odsoljavanje 1 do 10 µL puferiranih proteinskih otopina online.Odsoljeni protein se eluira u elektrosprej izvor iona Synapt G2Si masenog spektrometra (Waters) kroz sljedeći gradijent pufera A (voda/0,05% mravlja kiselina) i pufera B (acetonitril/0,045% mravlja kiselina), a temperatura stupca je 60 °C i brzina protoka od 0,1 mL/min: izokratska elucija s 5 % A tijekom 2 minute, zatim linearni gradijent do 95 % B unutar 8 minuta i održavanje 95 % B još 4 minute.
Detektiraju se pozitivni ioni s rasponom mase od 500 do 5000 m/z.Glu-fibrinopeptid B se mjeri svakih 45 sekundi za automatsku korekciju pomaka mase.Upotrijebite instrumentalni softver MassLynx s proširenjem MaxEnt1 za dekonvolvaciju prosječnog spektra nakon oduzimanja osnovne linije i izglađivanja.
UMPilirani HCoV-229E nsp9 digestiran je dodavanjem modificiranog tripsina stupnja sekvenciranja (Serva) i inkubiran preko noći na 37 °C.Chromabond C18WP centrifugalna kolona (broj dijela 730522; Macherey-Nagel) korištena je za odsoljavanje i koncentriranje peptida.Konačno, peptid je otopljen u 25 µL vode, koja je sadržavala 5% acetonitrila i 0,1% mravlje kiseline.
Uzorci su analizirani pomoću MS pomoću spektrometra mase Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Ultimativni nanoâ HPLC sustav (Dionex), opremljen prilagođenim krajnjim priključkom od 50 cm??Kolona C18 RP od 75 μm napunjena magnetskim zrncima od 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Povežite se na spektrometar mase online putem izvora nanospreja Proxeon;ubrizgajte 6 µL otopine za probavu tripsina u 300 µm unutarnjeg promjera ×??Kolona za pretkoncentraciju C18 PepMap od 1 cm (Thermo Scientific).Upotrebom vode/0,05% mravlje kiseline kao otapala, uzorak je automatski uhvaćen i desaliniziran brzinom protoka od 6 µL/min.
Sljedeći gradijenti vode/0,05% mravlje kiseline (otapalo A) i 80% acetonitrila/0,045% mravlje kiseline (otapalo B) korišteni su za postizanje odvajanja triptičkih peptida pri brzini protoka od 300 nL/min: 4% B za 5 minuta, zatim 30 A linearni gradijent do 45% B unutar minuta i linearni porast do 95% otapala B unutar 5 minuta.Spojite kromatografsku kolonu na nanoemiter od nehrđajućeg čelika (Proxeon) i raspršite eluent izravno na zagrijanu kapilaru masenog spektrometra pomoću potencijala od 2300 V. Pregledno skeniranje s rezolucijom od 60 000 u analizatoru mase Orbitrap povezano je s najmanje tri podatkovna MS/MS skeniranja, dinamički isključena na 30 sekundi, korištenjem linearne disocijacije izazvane sudarom ionske zamke ili disocijacije sudara veće energije u kombinaciji s detekcijom orbitrapa, rezolucija je 7500.
Vrijeme objave: 3. kolovoza 2021